Ολλανδοί ερευνητές συνδυάζουν το CRISPR και τη βιοφωταύγεια σε μια πειραματική δοκιμή γιαμεταδοτικές ασθένειες

Μια πρόσφατα αναπτυγμένη νυχτερινή πρωτεΐνη θα μπορούσε να επιταχύνει και να απλοποιήσει τη διάγνωση ιογενών ασθενειών, σύμφωνα με ερευνητές στην Ολλανδία.
Η μελέτη τους, που δημοσιεύτηκε την Τετάρτη στο ACS Publications, περιγράφει μια ευαίσθητη μέθοδο ενός βήματος για την ταχεία ανάλυση των ιικών νουκλεϊκών οξέων και την εμφάνισή τους χρησιμοποιώντας λαμπερές μπλε ή πράσινες πρωτεΐνες.
Η αναγνώριση των παθογόνων μικροοργανισμών με την ανίχνευση των δακτυλικών αποτυπωμάτων τους από νουκλεϊκό οξύ αποτελεί βασική στρατηγική στην κλινική διάγνωση, τη βιοϊατρική έρευνα και την παρακολούθηση της ασφάλειας των τροφίμων και του περιβάλλοντος.Οι ευρέως χρησιμοποιούμενες δοκιμές ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) είναι εξαιρετικά ευαίσθητες, αλλά απαιτούν πολύπλοκη προετοιμασία δειγμάτων ή ερμηνεία των αποτελεσμάτων, καθιστώντας τις μη πρακτικές για ορισμένες ρυθμίσεις υγειονομικής περίθαλψης ή ρυθμίσεις περιορισμένων πόρων.
Αυτή η ομάδα από την Ολλανδία είναι το αποτέλεσμα μιας συνεργασίας μεταξύ επιστημόνων από πανεπιστήμια και νοσοκομεία για την ανάπτυξη μιας γρήγορης, φορητής και εύχρηστης διαγνωστικής μεθόδου νουκλεϊκού οξέος που μπορεί να εφαρμοστεί σε διάφορα περιβάλλοντα.
Εμπνεύστηκαν από λάμψεις πυγολαμπίδων, λάμψεις πυγολαμπίδων και μικροσκοπικά αστέρια υδρόβιου φυτοπλαγκτού, όλα τροφοδοτούμενα από ένα φαινόμενο που ονομάζεται βιοφωταύγεια.Αυτό το αποτέλεσμα λάμψης στο σκοτάδι προκαλείται από μια χημική αντίδραση που περιλαμβάνει την πρωτεΐνη λουσιφεράση.Οι επιστήμονες ενσωμάτωσαν πρωτεΐνες λουσιφεράσης σε αισθητήρες που εκπέμπουν φως για να διευκολύνουν την παρατήρηση όταν βρίσκουν έναν στόχο.Αν και αυτό καθιστά αυτούς τους αισθητήρες ιδανικούς για ανίχνευση σημείου φροντίδας, επί του παρόντος δεν διαθέτουν την υψηλή ευαισθησία που απαιτείται για κλινικές διαγνωστικές δοκιμές.Ενώ η μέθοδος επεξεργασίας γονιδίων CRISPR μπορεί να παρέχει αυτή τη δυνατότητα, απαιτεί πολλά βήματα και πρόσθετο εξειδικευμένο εξοπλισμό για την ανίχνευση του ασθενούς σήματος που μπορεί να υπάρχει σε πολύπλοκα, θορυβώδη δείγματα.
Οι ερευνητές βρήκαν έναν τρόπο να συνδυάσουν μια πρωτεΐνη που σχετίζεται με το CRISPR με ένα βιοφωταυγές σήμα που μπορεί να ανιχνευθεί με μια απλή ψηφιακή κάμερα.Για να βεβαιωθούν ότι υπήρχε αρκετό δείγμα RNA ή DNA για ανάλυση, οι ερευνητές πραγματοποίησαν ενίσχυση πολυμεράσης ανασυνδυασμού (RPA), μια απλή τεχνική που λειτουργεί σε σταθερή θερμοκρασία περίπου 100°F.Ανέπτυξαν μια νέα πλατφόρμα που ονομάζεται Luminescent Nucleic Acid Sensor (LUNAS), στην οποία οι δύο πρωτεΐνες CRISPR/Cas9 είναι ειδικές για διαφορετικά συνεχόμενα τμήματα του ιικού γονιδιώματος, το καθένα με ένα μοναδικό θραύσμα λουσιφεράσης συνδεδεμένο πάνω τους.
Όταν υπάρχει το συγκεκριμένο ιικό γονιδίωμα που εξετάζουν οι ερευνητές, δύο πρωτεΐνες CRISPR/Cas9 συνδέονται με την αλληλουχία νουκλεϊκού οξέος στόχου.βρίσκονται σε κοντινή απόσταση, επιτρέποντας να σχηματιστεί άθικτη πρωτεΐνη λουσιφεράσης και να εκπέμψει μπλε φως παρουσία χημικού υποστρώματος..Για να λάβουν υπόψη το υπόστρωμα που καταναλώθηκε σε αυτή τη διαδικασία, οι ερευνητές χρησιμοποίησαν μια αντίδραση ελέγχου που εξέπεμπε πράσινο φως.Ένας σωλήνας που αλλάζει χρώμα από πράσινο σε μπλε υποδηλώνει θετικό αποτέλεσμα.
Οι ερευνητές δοκίμασαν την πλατφόρμα τους αναπτύσσοντας την ανάλυση RPA-LUNAS, η οποία ανιχνεύειRNA SARS-CoV-2χωρίς κουραστική απομόνωση RNA και έδειξε τη διαγνωστική του απόδοση σε δείγματα ρινοφαρυγγικού επιχρίσματος απόCOVID 19ασθενείς.Το RPA-LUNAS εντόπισε επιτυχώς τον SARS-CoV-2 μέσα σε 20 λεπτά σε δείγματα με ιικό φορτίο RNA τόσο χαμηλό όσο 200 αντίγραφα/μL.
Οι ερευνητές πιστεύουν ότι η ανάλυση τους μπορεί εύκολα και αποτελεσματικά να ανιχνεύσει πολλούς άλλους ιούς.«Το RPA-LUNAS είναι ελκυστικό για δοκιμές μολυσματικών ασθενειών στο σημείο της φροντίδας», έγραψαν.